原标题：蜂针对胶原诱导关节炎大鼠下丘脑-垂体-肾上腺轴的影响

作者：1周颖芳，2黄胜光，3李万瑶（1 广州医学院第三附属医院，广州 510150 ；2 深圳市第六人民医院，深圳 518052；3 广州中医药大学，广州，510405 ）

来源：《中国针灸学会临床分会全国第十九届针灸临床学术研讨会论文集》2011年

[摘要] 目的：观察蜂针对胶原诱导关节炎（CIA ）大鼠下丘脑-垂体-肾上腺轴 (HPA轴) 的影响。方法：采用弗氏不完全佐剂乳化的Ⅱ型胶原乳剂造模。将53只造模成功的大鼠随机分为模型组、蜂针肾俞组、蜂针后三里组、西药组、蒸馏水组等，并设立正常组进行对照。其中西药组 13 只大鼠，其余各组每组10只大鼠。结果：蜂针组与西药组大鼠的 IL-1、IL-6 及 TNF-α等致炎细胞因子水平低于模型组，差异有统计学意义(P＜0.05) 。与模型组比较，蜂针肾俞组、蜂针后三里组大鼠的 CRH 和 ACTH 水平低于模型组，差异有统计学意义(P＜0.05 或 P＜0.01) ；蜂针肾俞组大鼠的COR 水平高于模型组，差异有统计学意义(P ＜0.01) 。 结论：蜂针可有效抑制CIA 大鼠体内细胞因子的水平，改善 HPA 轴免疫调节的作用。

[关键词] 蜂针；胶原诱导关节炎；下丘脑-垂体- 肾上腺轴

类风湿性关节炎(RA)是一种慢性进行性关节病变为主的自身免疫性疾病，在临床上，蜂针治疗类风湿性关节炎的疗效已逐步得到公认，但具体的作用机制尚处于研究当中。建立 RA 动物模型是进行 RA 研究的重要环节，目前RA的动物 模型有多种，在国内外已有很多与 Ⅱ型胶原诱导的关节炎（Collagen-Induced Arthritis ，CIA ）动物模型的临床表现、病理组织学及免疫学相关的研究。其主要表现为多发性末端关节炎，关节局部红肿，病理变化为增生性滑膜炎，关节软骨破坏，关节腔内大量炎性细胞浸润。由于 CIA 动物模型病理特征与 RA的相似性，被广泛应用于 RA 发病机制及治疗方面的研究。随着分子生物学和免疫学的发展，发现细胞因子、下丘脑－垂体－肾上腺轴（HPA轴）等在类风湿性关节炎的发病过程中均起着重要作用。因此，本课题通过注射弗氏不完全佐剂乳化的Ⅱ型胶原建立 CIA 大鼠模型，借以阐释 HPA 轴在治疗类风湿性关节炎中的作用机制。

1 实验材料及方法

1.1 动物与材料

选用 SPF级SD大鼠80只，雄性，体重180±20g，由广州中医药大学动物中心提供（动物合格证号0014811，0015810，0014991）。

牛Ⅱ型胶原蛋白，Chondrex 公司，批号为050266 ；弗氏不完全佐剂（Freund’s Adjuvant Incomplete，IFA ），美国SIGMA 公司，批号为104K8926；注射用甲氨蝶呤，浙江万马药业有限公司，规格为5mg/支，批号为050504；注射用水，广东神州制药有限公司，批号为 200512282 ；冰醋酸，汕头市光华化学厂，批号为20030301；活蜂（中华蜜蜂），由广州中医药大学第一附属医院提供（产于谭新蜂业有限公司）。

1.2 仪器与试剂

SN-695B型放免γ测量仪（上海原子核所日环仪器一厂）。

IL-1、IL-6、TNF-α（批号：060630）放免试剂盒由解放军总医院放免所提供。COR 放免试剂盒（批号：060625）由北京科美东雅生物技术有限公司提供；ACTH 放免试剂盒（批号：060601）由北京北方生物技术研究所提供；CRH（批号：060625）由第二军医大学提供。

1.3 造模方法

（1）乳剂的制备

胶原：在实验前一天晚上，将胶原（胶原必须保持低温以防止变性）以2mg/ml的比例溶解于0.05M 的醋酸中，操作时必须在4 ℃以下匀速、轻轻搅拌。乳化：按照 1：1 比例在佐剂中乳化胶原。① 用注射器将 3ml 弗氏不完全佐剂加入到容积为 10ml 的注射器/试管中。② 将等体积的胶原溶液（3ml）逐滴加入混合中的佐剂。③ 在冰浴下充分研磨乳化，直到僵硬的乳剂形成，浓度为 1mg/ml。④ 测试乳剂的稳定性：往装水的烧杯中滴入一滴，如果此滴乳剂保持固态团块，则是稳定的；如果乳剂分散到了水的表面，则不稳定，此时可以加几滴佐剂并再次混合。

（2 ）动物造模

将乳剂输入装有30号针头的 1ml 汉密尔顿玻璃注射器。在距离每只大鼠尾根部 1-2cm 的部位皮内注射乳剂 0.2ml（含0.2mg胶原蛋白），此时可见真皮下的白色皮丘。针头斜面向上并与尾部平行插入。

1.4 动物分组

将造模成功的SD大鼠 53 只随机分为模型组、蜂针肾俞组、蜂针后三里组、西药组、蒸馏水组等，并设立正常组进行对照。其中西药组 13只大鼠，其余各组每组10只大鼠。

1.5 各组处理方法

在开始造模后的第15天，对各组大鼠进行处理。A 正常组：不作任何处理。B 模型组：造模后不作处理。C 蜂针肾俞组：活蜂蛰刺肾俞穴（第二、三腰椎棘突间旁开 1.5cm 处），1只蜜蜂/天/只鼠，隔日1次，两侧交替。半个月后增加用蜂数量至 2 只/天/只鼠，取双侧肾俞穴，针后不拔针。D 蜂针后三里组：活蜂蛰刺后三里穴（小腿背外侧上1/5 折点处，约当腓骨小头下 1.2cm，胫骨嵴后1cm），1 只蜜蜂/天/只鼠，隔日1次，两侧交替。半个月后增加用蜂数量至 2 只/天/只鼠，取双侧后三里穴，针后不拔针。E 西药组：后三里穴注射甲氨蝶呤，用注射用2ml溶解5mg甲氨蝶呤针剂，根据人和动物按体表面积折算[2]的等效剂量为0.35ml/只，每周1次。治疗1周后，该组已死亡4只大鼠，疑为药物过量所致， 将注射剂量减半，约为0.175ml/只。F 蒸馏水组：在后三里穴注射与甲氨蝶呤等量的蒸馏水，隔日1次。蒸馏水组在治疗一周后将注射剂量相应地减半，约为0.175ml/只。上述各治疗组分别治疗1个月。

1.6 观察指标

（1）细胞因子IL-1、IL-6、TNF-α的测定

以毛细玻管眼眶后静脉取血，静置后离心，离心机转速为2500r/min ，离心20min ，取血清待测。严格按照试剂盒说明书操作。

（2）HPA 轴产物：CRH、ACTH、COR的测定

取静脉血（眼眶后静脉取血），CRH、ACTH需抗凝后离心，取血浆待测。COR不需抗凝，可静置后离心，取血清待测。离心机转速为 2500r/min ，离心20min 。严格按照试剂盒说明书操作。

1.7 统计学处理

所有数据资料均在SPSS 11.5 软件上建立数据库，进行统计分析，计量资料以均数±标准差（±s）表示。正常组与模型组比较采用独立样本t检验，自身治疗前后比较采用配对t检验。各组间比较，若方差齐性，采用单因素方差分析； 方差不齐，采用Games-Howell 法。

2 实验结果

2.1 细胞因子测定结果

IL-1、IL-6 和 TNF-α等细胞因子的生物效应是通过网络化工作而实现的，它们可在 HPA 轴的各个水平调节其产物的分泌。本实验结果显示如表 1。

模型组与正常组比较，模型组大鼠的 IL-1、IL-6 及 TNF-α水平明显高于正常组，差异有统计学意义(P＜0.01)，提示造模后关节炎大鼠体内细胞因子水平明显高于正常状态。蜂针肾俞组、蜂针后三里组、西药组与模型组比较，蜂针组与西药组大鼠的致炎细胞因子水平低于模型组，差异有统计学意义(P＜0.05) 。蒸馏水组与模型组比较，蒸馏水组大鼠的 IL-1、IL-6 及 TNF-α水平虽然数值上低于模型组，但差异无统计学意义(P＞0.05) 。

表1 各组大鼠IL-1、IL-6、TNF-α水平的变化（±s）

 

注：与正常组比较，▲P＜0.01；与模型组比较，﹡P＜0.05；与蜂针后三里组比较，★P＜0.01。

2.2 HPA 轴相关产物测定结果

本实验通过对CIA大鼠HPA轴相关产物CRH、ACTH及COR的测定，旨在分析治疗前后HPA轴不同水平代谢产物的变化，阐明HPA轴在 CIA发病机制中的作用。结果见表2。

表2 各组大鼠HPA 轴产物 CRH、ACTH 、COR 水平的变化 （x s ）

注： ▲与正常组比较，P＜0.01；﹡与模型组比较，P＜0.05或 P＜0.01；★与蜂针后三里组比较，P＜0.01 。

模型组与正常组比较，模型组大鼠CRH与ACTH水平高于正常组；COR水平低于正常组，差异有显著统计学意义（P＜0.01）。与模型组比较，蜂针肾俞组、蜂针后三里组大鼠的 CRH 和 ACTH 水平低于模型组，差异有统计学意义(P＜0.05 或 P＜0.01) ；蜂针肾俞组大鼠的 COR 水平高于模型组，差异有统计学意义(P＜0.01) 。然而，模型组与蒸馏水组CRH、ACTH 及 COR 水平的比较显示，差异无统计学意义（P＞0.05 ），提示单纯穴位刺激对 HPA 轴的调节作用较差。

西药组与模型组大鼠的 CRH、ACTH及COR水平的比较显示，差异无统计学意义（P＞0.05）。

3 讨论

本实验采用了蜂针、西药等治疗方法抑制CIA炎症反应、调节免疫功能，现从微观角度予以阐述。

3.1 抑制炎症介质的释放

在RA的炎症过程中，存在着多种炎症介质，其中IL-1β、TNF-α、IL-6 等具有致炎性作用的细胞因子在类风湿关节炎的发病过程中起着重要作用，在类风湿关节炎的病变关节局部常有大量炎症细胞浸润，这些炎症细胞可以通过分泌致炎性细胞因子，诱导蛋白酶活性和激活破骨细胞，导致关节滑膜炎症反应和关节[3]软骨破坏。CIA动物模型与 RA 均有滑膜细胞增生和肥大等不同程度炎性改变， 因此，抑制致炎细胞因子的活性对于治疗CIA 大鼠的关节炎症非常重要。

本实验结果提示：造模后，模型组大鼠的 IL-1、IL-6 及 TNF-α水平明显升高，说明造模较成功。选用蜂针“肾俞”穴、“后三里”穴，及甲氨蝶呤“后三里”穴注射，可明显降低大鼠体内致炎细胞因子水平，抑制其在病理过程中的作用，缓解关节红肿等症状。蒸馏水组大鼠的IL-1、IL-6 及 TNF-α水平数值上低于模型组，但差异无统计学意义（P＞0.05），提示选用同一穴位治疗，蜂针与西药甲氨蝶呤优于蒸馏水注射，表明仅有穴位的作用尚不足以抑制炎症反应，通过药物或蜂毒的刺激使得效果更为明显。

3.2 HPA 轴在抗炎免疫中的作用

1990年，Wilder等提出 HPA 轴与炎症性疾病的发生和持续发展有关，而众多的研究也表明，RA患者肾上腺皮质功能紊乱，皮质醇分泌节律异常。皮质醇（Cortisol，COR）是肾上腺皮质束状带分泌的糖皮质激素，其分泌受下丘脑-垂体- 肾上腺轴(HPA轴) 的调控。糖皮质激素对免疫系统功能的影响极为广泛，它能抑制白细胞、单核细胞以及巨噬细胞向炎症区域聚集，并且能明显抑制这些细胞产生和释放细胞因子，如白细胞介素 1(IL-1)、白细胞介素 6(IL-6)、肿瘤坏死因子(TNF)、干扰素(INF)等，对机体的免疫功能具有重要作用。

结合表1中关于细胞因子的结果分析：造模后，模型组大鼠的致炎细胞因子IL-1、IL-6 和 TNF-α 等明显升高，而皮质醇含量却显著低于正常组，提示CIA模型大鼠体内的皮质醇不足以抑制炎症的发生，且存在皮质醇分泌的异常。造模后，模型组大鼠的ACTH和CRH水平却显著升高，这是由于两方面的作用，一是 COR 水平降低，反馈性引起 ACTH和CRH 水平的升高；二是细胞因子对下丘脑的直接刺激，使ACTH和CRH的分泌增加。正常状态下，ACTH 可促进皮质醇的分泌，从而抑制IL-1、IL-6等细胞因子的致炎作用，构成细胞因子和 HPA 轴之间精密的神经内分泌调节环路。然而，CIA 大鼠的这一环路却不能有效发挥其作用抑制模型组大鼠的炎症，这可能是由于肾上腺皮质功能的缺损所致。

本实验结果显示：治疗后，蜂针肾俞组大鼠的 COR 水平高于模型组，CRH和ACTH 水平则较模型组明显降低，提示蜂针肾俞穴有抑制细胞因子产生、改善[5] HPA 轴免疫调节的作用。与以往的报道相似，杨氏等采用蜂针治疗实验性类风湿性关节炎，观察蜂针对实验大鼠的血清及滑膜浸液 IL-1β、IL-6的变化，以氢化可的松为阳性对照组。结果提示蜂针治疗组的大鼠血清及滑膜浸液的IL-1β、IL-6的水平较模型组明显降低（P＜0.01、P＜0.05 ）。表明蜂针具有抑制佐剂性关节炎（AA）大鼠细胞因子的异常分泌的作用，以阻止AA大鼠免疫性炎症的发展。而甲氨蝶呤则是通过抑制自身免疫反应，产生抗炎作用。甲氨蝶呤是二氢叶酸还原酶的抑制剂，可引起细胞内叶酸缺乏，使核蛋白合成减少，抑制细胞增殖和复制。因此，蜂针可抑制大鼠体内细胞因子的产生，改善肾上腺皮质的功能，使HPA轴环路的分泌调节趋于正常。细胞因子水平的降低反馈性地使CRH和ACTH的分泌减少，但 CIA 炎症的持续存在导致大鼠体内的细胞因子水平仍然高于正常状态，所以 CRH 与 ACTH 的分泌也高于正常。同时，由于治疗后肾上腺皮质功能得到了一定的改善，分泌增多的皮质醇抑制免疫细胞释放细胞因子，减轻淋巴细胞浸润和迁移，从而达到抗炎的作用。

参考文献

[1] Immunization Grade Type ⅡCollagen and Adjuvant Catalog # 2001-2005. Arthrogen-CIA Reagents & Consulting for Arthritis Research. Chondrex, Inc.

[2] 苗明三.实验动物和动物实验技术.1997年6月第1版 SS号:10312568:489.

[3] 沈杰，杨晓凌，许荣.致炎性细胞因子与类风湿关节炎的相关性研究.浙江预防医学，2002,14(7):12-13.

[4] 田玉.促肾上腺皮质激素在类风湿关节炎中的作用.国际检验医学杂志. 2006,27(1):40-43.