蜂毒素抗肿瘤的研究分析

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原标题：蜂毒素抗肿瘤

作者：刘洁

来源：佛山市第一人民医院脑科康复医院

蜂毒是工蜂毒腺和附腺分泌出的具有芳香气味的一种透明毒液，贮存在毒囊中，螫刺时由螫针排出，其化学成分比较复杂，包括多肽类、酶类和非肽类物质，主要有效成分是蜂毒素、蜂毒神经肽、磷脂酶A2、透明质酸酶、多巴胺和组织胺等[1]，其中约占蜂毒干重50%的蜂毒肽（即蜂毒素，melittin，MLT）是蜜蜂毒的主要成分。研究资料显示蜂毒素对多种实验性肿瘤有强烈的杀伤作用。

刘岭等观察发现在8.0mg/ml以上剂量时，蜂毒素对于3种体外肿瘤细胞（SMMC27721、BEL27402 和Hep23B）在很短时间内即出现明显的细胞毒作用，而作用时间对于其抑瘤率的影响并不显着，考察蜂毒素抑瘤作用的量效关系，发现在8.0～64.0mg/ml剂量时，蜂毒素的抑瘤率直线上升[2]，凌昌全等的实验研究亦得出了类似结果[3]。许天敏等体外实验观察到蜂毒肽对卵巢癌细胞株生长有抑制作用，并且随着其浓度的增加抑制作用增强，在卵巢癌皮下移植瘤动物模型中，注射蜂毒肽各组瘤重明显低于对照组（P<0.05），与阳性药物CTX组之间无显着性差异（P>0.05）[4]。

研究表明蜂毒素的抗肿瘤作用，是对肿瘤细胞的多靶点作用的结果：

1 抑制血管生成

血管生成是目前公认的肿瘤生长和转移的病理基础和必要条件，新生血管为肿瘤的生长提供养分，保证其生长增殖，同时由于与个体的血液循环系统相通，也为肿瘤发生远处转移提供通路[5]。

肿瘤血管生成是由血管内皮细胞、肿瘤细胞、以及肿瘤微环境相互作用的结果，其中血管内皮细胞的增殖、侵袭、迁移和分化是新生血管形成过程中的关键环节，因此，在肿瘤治疗中，以血管内皮细胞为靶向的治疗很有可能成为有前途的治疗手段[6]。宋长城等研究发现蜂毒素可以抑制人脐静脉内皮细胞的增殖生长，引发细胞周期阻滞，诱导细胞凋亡，并且可以下调促血管生成因子的表达，说明蜂毒素具有抑制血管生成的作用[7]；其在另一探讨蜂毒素的体内抑瘤效应及其可能的作用机制的实验中，发现蜂毒素处理组VEGF（血管内皮细胞生长因子）的表达显着低于模型组（P<0.01），认为蜂毒素能够明显抑制人肝癌细胞裸鼠移植瘤的生长的作用机制可能与下调VEGF的表达，抑制肿瘤血管生成有关[8]。

血管生成拟态（ vasculogenic mimicry，VM）是恶性肿瘤获取营养物质的一种方式，是肿瘤细胞通过自身形变围成管状结构，为肿瘤供血促进其生长转移[9]。研究发现2种蛋白分子HIF-1a，MMP-2与肿瘤VM的形成密切相关。高启龙等的实验表明，小剂量蜂毒素能够下调骨肉瘤HIF-1a和MMP-2蛋白的表达，从而抑制骨肉瘤细胞拉长变形，使其失去内皮细胞表型，不能形成管状结构，明显减少移植瘤内的VM密度，减少肿瘤血供，从而抑制骨肉瘤的生长转移[10]。

微血管密度（microvessel density，MVD）是目前公认的衡量肿瘤血管生成的定量指标，研究发现多种肿瘤的预后都与其相关。秦刚等实验发现与阴性对照组比较，蜂毒素各浓度组瘤体内MVD、SDF-1a（基质细胞源性因子1a，stromal cell-derived factor 1a）及CXCR4（基质衍生因子受体4，chemokine receptor 4）均减少（P＜0.05），认为蜂毒素能减少荷骨肉瘤裸鼠瘤体微血管生成，抑制骨肉瘤的生长，其作用机制可能与蜂毒素能降低SDF-1a及CXCR4蛋白表达有关[11]。

2 抑制肿瘤细胞增殖活性，阻滞肿瘤细胞增殖周期

恶性肿瘤细胞过度生长，不断增殖是其特征之一，因而能有效地抑制肿瘤细胞的生长、增殖，成为抗肿瘤药物的一个重要要求。

作为DNA聚合酶的复合因子，增殖性细胞核抗原（PCNA）（亦称周期蛋白，cyclin），可以调节DNA的合成，也能参与非程序化的DNA合成，在细胞增殖过程中有重要意义，其含量反映了细胞增殖的程度。张晨等为研究蜂毒素对肝癌细胞生长、增殖的影响，先后实验发现，蜂毒素体外能够抑制肝癌细胞SMMC7721[12]、BEL-7402[13]的增殖活性，并抑制细胞增殖核抗原的表达，而且PCNA阳性细胞表达率随着蜂毒素剂量的增加而降低，呈剂量依赖性；更有凌昌全等实验发现蜂毒素在体内外对小鼠肝癌H22细胞增殖均有明显的抑制作用，其抑制作用随药物浓度增加而增强，蜂毒素作用于H22细胞后，细胞PCNA平均荧光强度低于对照组[14]；根据以上实验结果推断，蜂毒素能够抑制肝癌细胞的增殖，可能与其降低PCNA的表达相关。

从细胞上一次分裂结束开始生长，到下一次分裂终了所经历的过程就是一个细胞周期，反映了细胞增殖分裂这一细胞最基本的生理活动。事实上，细胞周期各个时相的生化变化过程都是连续的，无论细胞周期哪一个阶段的生物合成被阻断，都将导致整个细胞周期的中断。肿瘤细胞周期异常，可无限地增殖，因此，肿瘤治疗就可以通过干扰肿瘤细胞的细胞周期达到影响细胞的生长、增殖的目的。李玉梅等采用MTT法观察蜂毒素对人成骨肉瘤细胞增殖的影响，发现蜂毒素能够剂量依赖性地抑制人成骨肉瘤细胞的增殖，在此基础上，分别应用流式细胞仪和免疫细胞化学方法检测了蜂毒素作用前后骨肉瘤细胞周期和增殖细胞核抗原（PCNA）表达的变化，发现其能下调PCNA表达，并将细胞周期阻滞于S期，造成S期细胞堆积，阻碍其向G2/M期的转换，减缓其分裂的速度，从而抑制其增殖[15]。黄舒然等观察不同浓度的蜂毒素（32，16，8，4，2mg/ml）体外对人胃癌细胞株BGC-823增殖的影响，与阴性对照比较，蜂毒素作用24小时后S期细胞比例上升，而G0/G1期比例明显下降，蜂毒素浓度达到16mg/ml时，G0/G1期前出现明显的亚二倍体区，改变其细胞周期[16]。

3 诱导肿瘤细胞凋亡

细胞凋亡是肿瘤生长的一个重要调节因素，肿瘤不仅是细胞增殖和分化紊乱的疾病，也是凋亡异常疾病[17]。所以，细胞凋亡作为抗癌药物的攻击靶点之一，也成为了研究热点。

Fas蛋白是细胞表面诱导凋亡的死亡受体，Fas蛋白与Fas蛋白配体（FasL）结合后向细胞内传递死亡信号，激活Caspase而引发细胞凋亡[18]。张晨等实验发现，用8、16、32mg/ml蜂毒素处理后，BEL-7402细胞线粒体膜蛋白7A6表达率由对照组的1.02%，分别上升到4.89%、17.74%和11.45%；细胞表面Fas蛋白表达明显增加，FasL表达没有变化；RT-PCR扩增结果显示，32mg/ml蜂毒素处理细胞后，Fas灰度比值高于对照组，没有扩增出FasL表达条带，得出结论，蜂毒素诱导肝癌细胞凋亡可能与影响线粒体膜蛋白7A6表达及凋亡相关基因产物Fas及其配体FasL信号传导途径有关[19]。Apo2.7蛋白位于线粒体膜上，是线粒体膜上38 kDa的蛋白，为细胞凋亡相关蛋白，与细胞凋亡早期密切相关[20]。陈永强等以流式细胞仪检测结果显示，16mg/L、32mg/L蜂毒素作用于骨肉瘤细胞U2OS细胞24h后，Fas蛋白的表达率由（22．82±1．83）%分别上升为（80.20±12.75）%、（80.07±8.39）%（P<0.01）；Apo2.7表达率则由（0.81±0.22）%分别上升为（46.33±5.34）%和（57.94±4.52）%（P<0.01），认为蜂毒素的促U2OS凋亡作用，可能与增加Fas和Apo2.7蛋白有关[21]。

Bcl-2家族蛋白中的Bax与线粒体途径关系密切，通常Bax与Bcl-2形成异源二聚体，此时细胞不易凋亡，而当Bax增多时，则以Bax本身形成的同源二聚体为主，在凋亡信号刺激下，Bax会从细胞质转移到线粒体膜上形成同源二聚体，通过线粒体通透性改变、破坏氧化磷酸化和ATP的合成功能，使线粒体释放AIF、Smac和细胞色素C，进一步激活Caspase-3诱导细胞发生凋亡[22]；研究表明，野生型p53有放大线粒体凋亡途径的作用，是典型的抑癌基因。王怡苹等通过流式细胞仪分析、DNA凝胶电泳、透射电镜下形态学观察等方法检测发现，蜂毒素具有诱导SGC-7901细胞发生凋亡的作用，进一步研究发现，蜂毒素作用SGC-7901细胞48h后Bcl-2蛋白和Bcl-2mRNA的表达明显降低，Bax蛋白、Bax mRNA和p53的表达明显增高，并随蜂毒素浓度增加而加强，推断蜂毒素诱导人胃SGC-7901细胞凋亡的作用机制可能与调控Bcl-2、Bax、p53基因表达有关[23]。候毅等观察发现蜂毒素处理人膀胱癌T24细胞后，细胞出现典型的凋亡形态学改变，凋亡率随剂量升高以及Bax的表达升高而Bcl-2表达下降[24]。

4 蜂毒素具有免疫调节作用

人体免疫系统具有免疫防御、免疫自稳、免疫监视的生理功能，其中免疫监视是指机体杀伤和清除异常突变细胞防治发生肿瘤的能力，一旦免疫功能低下，就容易发生肿瘤，反之，增强机体的免疫功能可以作为抗癌的途径之一。

脾脏和胸腺是人体重要的免疫器官，其脏器指数可以作为衡量机体免疫功能的初步指标；T淋巴细胞、B淋巴细胞、NK细胞以及巨噬细胞等是机体主要的免疫细胞，IL-1、IL-2及TNF-a是重要的免疫炎症因子，在抗肿瘤的过程中具有重要意义。王朋景等探讨蜂毒素对人肝癌HepG-2细胞株裸鼠移植瘤的抑制作用，实验结果表明蜂毒素可以提高荷瘤小鼠体内IL-1及TNF-a的分泌水平，并且可以提高裸鼠的脾脏指数，提示增强裸鼠的免疫功能可能是蜂毒素抑制肿瘤的机制之一[25]。楼蓉等研究发现蜂毒素（2、4mg/kg）能抑制荷瘤小鼠（人胃癌SGC-7901细胞裸鼠移植瘤）的肿瘤生长，提高脾脏指数，增强腹腔巨噬细胞吞噬功能和NK细胞的活性，蜂毒素（4mg／kg）能增加血清中IL-2的含量，认为蜂毒素对荷瘤小鼠具有较强的抑瘤作用，可能与其提高机体免疫功能有关[26]。

综上所述，蜂毒素对于实验性肿瘤细胞的抑瘤作用是多靶点作用的结果，为蜂针疗法的抗肿瘤作用提供了确切的实验室依据。然而目前对蜂毒素抗肿瘤作用的基础性研究在数量上仍相对不足，涉及肿瘤细胞类型仍局限，机制研究仍欠深入，研究进展缓慢，且多是针对体外肿瘤细胞研究，荷瘤动物体内实验较少，未来蜂毒素研究的道路依然崎岖漫长。另随着分子生物学、生物技术工程、现代合成技术的发展及渗透，基因靶向治疗以及减毒增效新技术的创新研究将是广大蜂毒素抗肿瘤科研工作者努力的方向，发展潜力巨大。

参考文献

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