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柱前衍生RP-HPLC法测定国内外蜂蜜中17种游离氨基酸含量

2018年03月13日已有人阅读病友分享我想学蜂疗

祁龙凯1，林励1*，王小平2，邓少东3，李静1
（1.广州中医药大学中药学院广东广州 510006； 2.陕西中医药大学陕西西安 710246； 3.广东医科大学广东东莞 523808）

蜂蜜为采集植物的花蜜、分泌物或蜜露，与自身分泌物混合后，经充分酿造而成的天然甜物质［1］。《中国药典》中记载其性甘、平，归肺、脾、大肠经，具补中、润燥、止痛、解毒功效；外用生肌敛疮［2］。蜂蜜是一种高度复杂的半固态混合物，主要含有丰富的糖类，其次还含有黄酮类、酚酸类、蛋白质、酶类、氨基酸、矿质元素等微量成分，上述微量成分虽含量较低，但可能是蜂蜜发挥其药理药效作用的物质基础。
蜂蜜中氨基酸含量一般在0.1%-0.78%之间［3］，含有常见的18种氨基酸，其中以脯氨酸含量最高，占游离氨基酸总量50%以上［4］。不同蜂蜜中氨基酸种类和含量各具有差异，可作为鉴定蜂蜜蜜源植物、是否掺假的参考指标［5］。当前常用的氨基酸分析方法有分光亮度法［6］、同步荧光法［7］、氨基酸分析仪法［8］、柱前衍生法［3］等，其中氨基酸分析仪法及柱前衍生法因其快速、准确的特点，应用最为普遍。本文采用柱前衍生法测定和比较国内外蜂蜜中氨基酸含量差异，以期为蜂蜜质量控制提供部分参考。
1 仪器与材料
1.1 仪器： Waters 2695 高效液相色谱系统（PDA 检测器，美国 waters 公司）； Agilent 8453E；KQ-500 型超声波清洗器（中国昆山市超声仪器有限公司）。
德国 TKA 超纯水系统 GenPure（德国 TKA）； SK-1 型快速混匀器（江苏金坛市佳美仪器厂）；HH-S4 数显恒温水浴锅（常州普天仪器制造有限公司）。
1.2 材料
国内外蜂蜜样品（见表 1）；蜂蜜 17 种氨基酸对照品（阿拉丁试剂有限公司）；三乙胺（阿拉丁试剂有限公司，批号： 32214）；异硫氰酸苯酯（PITC，阿拉丁试剂有限公司，批号： E1412038）；无水醋酸钠（GR，阿拉丁试剂有限公司，批号： B1425062）；乙腈（色谱纯，德国 Merck 公司，批号： 1634930-216）；冰乙酸（色谱纯，天津科密欧试剂有限公司，批号： 20110513）； 732 强酸性苯乙烯系阳离子交换树脂（沧州宝恩吸附材料科技有限公司）；茚三酮、苯酚、浓硫酸等试剂均为市售分析纯。
表 1 国内外蜂蜜样品信息表
编号    蜂蜜品种    生产/最佳食用日期    生产商    产地
A1    荔枝蜜    2014-08-11    广州市谭山蜂业有限公司    广东
A2    百花冬蜜    2014-08-11    广州市谭山蜂业有限公司    广东
A3    梅花蜜    2014-08-11    广州市谭山蜂业有限公司    江西
A4    冬蜜    2014-08-11    广州市谭山蜂业有限公司    广东
A5    荔枝蜜    2013-09-18    广州市谭山蜂业有限公司    广东
A6    苕子蜜    2013-03-13    广州市谭山蜂业有限公司    云南
A7    椴树蜜    2013-03-26    广州市谭山蜂业有限公司    河北
A8    荔枝蜜    2013-01-18    广州市宝生园有限公司    广东
A9    洋槐花蜜    2013-01-16    广州市宝生园有限公司    浙江
A10    荔枝蜜    2013-09-26    海南卓津蜂业有限公司    海南
A11    荔枝蜜    2014-04-03    海南卓津蜂业有限公司    海南
A12    野藿香蜜    2012-11-20    广州市宝生园有限公司    云南
A13    益母草蜜    2012-12-11    广州市宝生园有限公司    云南
A14    荔枝蜜    2013-06-18    北京蜜蜂堂科技发展有限公司    广东
A15    茶花蜜    2013-04-06    广州市谭山蜂业有限公司    湖南
A16    荔枝蜜    2014-05-08    梅州蜂农    广东梅州
B1    Blueberry honey    2016-09-17    DUTCH GOLD    美国
B2    orange honey    2016-07-01    意大利有机尼奥    意大利
B3    Organic honey    2015-07-13    Rowse Honey Ltd.    英国
B4    Eucalyptus honey    2016-02-14    Famille Michaud    法国
B5    Red gum honey    2015-12-19    Beechworth Honey Pty Ltd.    澳大利亚
B6    Clover honey    2016-10-30    Comvita New Zealand Ltd.    新西兰
B7    Eucalyptus honey    2017-02-13    西班牙mielso公司    西班牙
B8    Blue borage honey    2016-06-18    New Zealand Honey Producers cooperative Ltd.    新西兰
B9    Leatherwood honey    2016-12-18    Australian Quality Honey Pty Ltd.    澳大利亚
B10    Thyme honey    2016-10-17    New Zealand Honey Producers cooperative Ltd.    新西兰
B11    Accacia honey    2008-01-21    法国圣桃园公司（ST.DALFROUR）    法国
B12    Blueberry honey    2016-08-23    LES RUCHERS PROMIEL INC    加拿大
B13    Rata honey    2015-11-29    New Zealand Honey Producers cooperative Ltd.    新西兰
B14    Reware honey    2016-02-04    New Zealand Honey Producers cooperative Ltd.    新西兰
B15    Kamahi honey    2015-06-07    New Zealand Honey Producers cooperative Ltd.    新西兰
B16    Manuka honey    2016-05-25    Honey Valley New Zealand Ltd.    新西兰
注：（A1～A16、B11标注为生产日期，B1～B10、B12～B16标注为最佳食用日期
国内蜂蜜样本为广州市谭山蜂业有限公司提供或本地超市自购，国外蜂蜜样本均购自香港，经广州中医药大学林励教授鉴定为蜜蜂科昆虫中华蜜蜂A. cerana或意大利蜂A. mellifera所酿的蜜；所有实验样品均保存于广州中医药大学实验管理中心。
2 方法与结果
2.1 对照品溶液的制备
2.1.1 对照品溶液母液配置
称取 17种氨基酸对照品适量，精密称定，置于50 mL量瓶中，加入适量硼酸缓冲液（pH=10），超声溶解，用硼酸缓冲液定容至刻度，摇匀后，备用。 17种氨基酸对照品溶液浓度见表2。
2.1.2 对照品工作液配置
量取上述对照品溶液 1、2、4、6、8、10 mL，精密量取，置于10 mL量瓶中，用硼酸缓冲液定容至刻度，摇匀后即得不同浓度的氨基酸对照品工作液。
表 2 17种氨基酸对照品母液浓度
氨基酸    浓度（μg/mL）    氨基酸    浓度（μg/mL）
天冬氨酸（Asp）    51.0    酪氨酸 (Tyr)    57.0
谷氨酸（Glu）    26.8    缬氨酸 (Val)    51.6
丝氨酸（Ser）    52.4    蛋氨酸 (Met)    22.2
甘氨酸（Gly）    56.6    异亮氨酸(Ile)    55.2
组氨酸（His）    37.6    亮氨酸 (Leu)    45.4
精氨酸（Arg）    26.2    苯丙氨酸(Phe)    131.6
苏氨酸（Thr)    26.4    色氨酸(Trp)    44.8
丙氨酸 (Ala)    42.6    赖氨酸 (Lys)    44.2
脯氨酸 (Pro)    243.8
2.2 供试品溶液的制备
2.2.1 层析柱预处理：采用饱和 NaCl溶液浸泡732阳离子交换树脂12 h，用蒸馏水洗净后，先后以4% NaOH 溶液、4% HCl溶液浸泡8 h，最后用去离子水洗至pH值为中性时装柱。
2.2.2 氨基酸吸附：称取蜂蜜约10.0 g，精密称定，置于烧杯中，加入40 mL去离子水，搅拌溶解后，用盐酸调节pH 值至2.0，超声处理 10 min，过滤后过 732 阳离子交换树脂柱（16mm×300 mm），流速1.0 mL/min。
2.2.3 氨基酸洗脱
阳离子交换柱用去离子水洗至硫酸苯酚法检测无明显变色反应，用2mol/L氨水溶液 50 mL洗脱，流速1.0 mL/min，收集氨水部分， 50℃蒸干溶剂，用适量硼酸缓冲液（pH=10）溶解定容至 25 mL，备用。
2.3 柱前衍生方法
2.3.1 衍生试剂配置
量取三乙胺试剂0.7 mL置于5 mL具塞PE管中，加入4.3 mL乙腈，混匀即得三乙胺乙腈溶液；吸取PITC试剂100 μL，置于10 mL具塞PE管中，加入 7.9 mL乙腈，混匀即得PITC乙腈溶液。
2.3.2 氨基酸衍生
量取备用样品溶液 1 mL，精密量取，置于 2 mL离心管中，依次加入 14%三乙胺乙腈溶液 100 μL、 1.25% PITC乙腈溶液 100 μL，涡旋 1 min，置于 30℃恒温箱中静置1h，而后加入 300 μL正己烷，振摇后静置 10 min，除去上层溶液，重复萃取 1 次，取下层溶液，过 0.45 μm滤膜，取滤液备用。
2.4 色谱条件
     Waters Symmetry C18 色谱柱（4.6 mm×250 mm， 5 µm）；流动相： A 为乙腈：水（4:1）， B 为 30 mM/L 醋酸钠溶液：乙腈（355:15），用冰乙酸调节 pH=6.5，梯度洗脱，洗脱程序见表3；检测波长：254 nm；柱温：40℃；进样量10 μL。
表 3 洗脱程序
Time/min    A/%    B/%
0    0    100
3    3    97
18    6    94
19    21    79
38    100    0
45    0    100
48    0    1
2.5 系统适应性试验
取空白溶剂、对照品溶液和供试品溶液各 10μL，按照”2.4”项下色谱条件进样分析，考察系统适应性。结果见图 1。

1.天冬氨酸；2.谷氨酸；3.丝氨酸；4.甘氨酸；5.组氨酸；6.精氨酸；7.苏氨酸；8.丙氨酸；9.脯氨酸；10.酪氨酸；11.缬氨酸；12.蛋氨酸；13.异亮氨酸；14.亮氨酸；15.苯丙氨酸；16.色氨酸；17.赖氨酸
图1 空白溶剂（A）、供试品溶液（B）及对照品溶液（C） HPLC色谱图
2.6 标准曲线绘制
取“2.1”项下对照品溶液，依照“2.3”项方法衍生，量取 20 μL注入高效液相色谱仪，按照“2.4”项下色谱条件测定，以峰面积积分值Y 为纵坐标，进样浓度（μg/mL）X 为横坐标绘制标准曲线， 17种氨基酸标准曲线见表4。
表 4 17种氨基酸标准曲线
氨基酸    标准曲线    R 值    线性范围（μg/mL）
Asp    y=9552.99x-317.36    0.9985    5.10-51.00
Glu    y=33138.22x-19433.85    0.9989    2.68-26.80
Ser    y=30630.25x-39351.37    0.9999    5.24-52.40
Gly    y=68285.69x-78448.99    0.9999    5.66-56.60
His    y=27769.35x-22412.81    0.9989    3.75-37.50
Arg    y=21523.97x-11176.08    0.9999    2.60-26.00
Thr    y =24950.00x-22118.36    0.9999    2.65-26.50
Ala    y=41467.40x-54158.86    0.9996    4.25-42.50
Pro    y=53876.88x-193486.13    0.9999    24.40-244.00
Tyr    y=32488.12x-33131.08    0.9999    5.70-57.00
Val    y=38405.10x-45923.25    0.9998    5.15-51.50
Met    y=31250.87x-3646.24    0.9999    2.20-22.00
Ile    y=37537.88x-33848.61    0.9989    5.50-55.00
Leu    y=37522.59x-30510.23    0.9999    4.55-45.50
Phe    y=33278.20x-71428.61    0.9995    13.15-131.50
Trp    y=36193.70x-24181.45    0.9996    4.50-45.00
Lys    y=40848.50x-57475.96    0.9999    4.40-44.00
2.7 方法学考察
2.7.1 精密度考察：取对照品溶液 1.0 mL，按照“2.3”项方法衍生，连续进样 6 次，记录各氨基酸色谱峰峰面积，计算各氨基酸色谱峰平均峰面积及其 RSD 值。结果各氨基酸峰面积 RSD 值均小于 3%，表明仪器精密度良好。
2.7.2 稳定性考察：取 A1 样品溶液 1.0 mL，按照“2.3”项方法衍生，分别在 0、2、4、8、12、24 h并按照”2.4”项下色谱条件进样分析，记录各氨基酸色谱峰峰面积，计算各氨基酸色谱峰平均峰面积及其 RSD 值.结果17种氨基酸在 24 h内6次测定，色谱峰峰面积的 RSD 值均小于3%，表明蜂蜜样品经衍生后在24 h稳定性良好。
2.7.3 重复性考察
称取同一蜂蜜样品（B8） 6份，每份约5.0g，精密称定，按照“2.2”项和“2.3”项制备及衍生，按照“2.4”项色谱条件进行分析，记录各氨基酸色谱峰峰面积，计算各氨基酸色谱峰平均峰面积及其 RSD 值。结果6次重复测定，各氨基酸色谱峰峰面积 RSD 均小于3%，表明该方法重复性良好。
2.7.4 加样回收率考察
称取 B8 蜂蜜样品 6份，每份约2.5g，分别加入各氨基酸对照品溶液适量，依照“2.2”项和“2.3”项制备及衍生，按照“2.4”项色谱条件进行分析，记录各氨基酸色谱峰峰面积，计算各氨基酸色谱峰平均峰面积、加样回收率及其 RSD 值，结果见表5。
表 5 加样回收率实验（n=6）
氨基酸    平均峰面积    平均加样回收率/%    RSD/%
Asp    53589    96.25    2.51
Glu    58469    93.48    3.59
Ser    125647    96.17    2.05
Gly    368541    94.58    1.07
His    35624    98.14    1.68
Arg    12589    102.59    2.79
Thr    28951    92.48    3.28
Ala    115624    103.69    2.64
Pro    3236254    97.18    2.18
Tyr    230596    93.84    3.02
Val    130589    97.52    1.96
Met    28541    104.62    2.50
Ile    66258    95.49    3.48
Leu    81256    98.18    2.56
Phe    756204    95.24    2.19
Trp    169524    96.07    2.58
Lys    80157    92.69    2.2
2.8 样品测定与结果
32 个国内外蜂蜜样品依次依照“2.2”项和“2.3”项制备及衍生，按照“2.4”项色谱条件进行分析，每个样品重复测定 3次，记录各样品中 17种氨基酸的平均含量，结果见表6。
表 6 国内外蜂蜜样品中 17 种氨基酸平均含量（n=3） mg/100g
编号    Asp    Glu    Ser    Gly    His    Arg    Thr    Ala    Pro
A1    1.26    0.73    1.69    1.22    0.74    0.33    0.97    1.84    17.42
A2    5.27    0.56    2.26    1.48    1.98    0.54    1.29    2.26    53.83
A3    3.76    0.93    1.83    1.50    0.97    0.57    1.22    2.51    31.42
A4    3.83    1.09    1.87    1.58    1.18    0.42    1.37    1.83    45.83
A5    2.55    0.42    1.73    1.68    1.28    0.43    0.96    1.71    26.14
A6    1.64    0.41    1.49    1.22    1.56    0.32    0.94    2.08    47.01
A7    0.96    0.25    1.01    1.05    0.86    0.00    0.00    1.17    19.41
A8    2.37    0.44    2.03    1.98    1.00    0.50    0.84    2.02    31.99
A9    1.10    0.38    1.26    1.53    1.58    0.51    0.89    1.75    56.87
A10    2.98    0.56    1.75    1.35    1.18    0.59    0.95    2.03    56.13
A11    2.59    0.47    1.45    1.18    1.15    0.59    0.75    2.31    41.82
A12    0.52    0.29    1.73    2.42    0.80    0.66    0.67    2.89    80.02
A13    0.44    0.35    1.62    2.05    1.47    0.85    0.00    1.76    48.73
A14    2.93    0.66    1.59    1.78    0.92    0.64    0.75    1.71    25.74
A15    3.05    0.69    1.74    1.87    1.83    0.68    1.07    2.08    59.98
A16    8.02    0.97    2.80    1.77    1.30    0.60    1.22    2.56    36.22
B1    4.22    1.28    1.96    2.32    1.96    0.39    1.03    2.49    66.40
B2    3.45    1.83    2.32    1.35    1.91    0.48    1.00    1.70    65.35
B3    1.61    0.54    1.46    1.58    1.30    0.41    0.70    2.00    53.97
B4    11.87    4.08    4.43    3.49    4.54    3.23    2.48    7.03    199.39
B5    2.51    0.45    1.56    1.58    2.14    0.50    0.92    1.99    83.21
B6    1.62    0.61    1.73    1.58    2.18    0.44    1.05    2.26    93.46
B7    5.17    0.94    2.05    2.26    2.61    0.92    1.08    3.01    95.36
B8    2.08    0.63    2.05    1.98    2.02    0.43    1.16    2.31    92.91
B9    2.77    0.37    1.21    1.10    1.31    0.35    0.66    1.53    36.67
B10    2.50    1.86    2.28    1.79    1.62    0.33    3.29    3.34    59.67
B11    3.85    0.62    2.25    1.54    2.00    0.56    1.29    3.21    83.25
B12    0.35    0.80    1.72    1.41    1.14    0.00    0.82    1.74    27.25
B13    8.99    0.45    1.94    1.45    1.28    0.38    1.15    1.85    48.92
B14    2.47    0.75    1.65    1.31    1.46    0.64    1.01    1.96    56.12
B15    2.31    0.50    1.69    1.48    2.43    0.76    0.93    1.72    71.34
B16    0.14    0.20    0.69    0.80    2.08    0.55    1.17    1.76    54.27
X（A)    2.7    0.58    1.74    1.6    1.24    0.51    0.87    2.03    42.41
X（B)    3.49    0.99    1.94    1.69    2    0.64    1.23    2.49    74.22
P值    p＞0.05    p＞0.05    p＞0.05    p＞0.05    p＜0.05    p＞0.05    p＞0.05    p＞0.05    p＜0.05

编号    Tyr    Val    Met    Ile    Leu    Phe    Trp    Lys    共计
A1    2.80    1.38    0.32    0.92    0.83    6.27    2.81    1.17    42.7
A2    2.11    1.98    0.12    1.36    1.16    32.61    2.99    3.38    115.18
A3    3.28    2.16    0.37    1.36    1.72    25.33    2.93    1.51    83.37
A4    4.91    1.83    0.32    1.46    1.11    97.79    2.95    1.96    171.33
A5    4.57    1.86    0.35    1.18    1.05    36.80    2.93    1.51    87.15
A6    2.79    1.37    0.34    0.88    0.74    5.13    2.90    1.73    72.55
A7    1.47    1.02    0.00    0.75    0.75    4.94    2.89    1.17    37.7
A8    2.36    1.94    0.35    1.16    1.33    9.85    2.93    1.42    64.51
A9    11.64    1.61    0.20    1.07    1.02    4.65    2.87    1.94    90.87
A10    5.91    1.75    0.52    1.21    1.16    13.52    2.88    2.18    96.65
A11    5.08    1.39    0.49    0.98    0.78    17.47    2.98    2.20    83.68
A12    4.52    2.55    0.37    3.02    1.24    16.08    2.23    1.61    121.62
A13    2.75    1.29    0.15    0.96    0.90    4.87    2.35    1.64    72.18
A14    3.09    1.79    0.75    2.19    2.36    16.54    2.25    1.75    67.44
A15    3.68    1.69    0.34    1.47    1.11    52.73    2.44    1.80    138.25
A16    2.86    1.96    0.17    1.18    1.26    8.74    2.44    2.06    76.13
B1    2.43    2.57    0.12    1.41    1.15    9.12    2.97    2.27    104.09
B2    1.47    1.68    0.00    0.98    0.75    3.43    3.29    3.74    94.73
B3    1.95    1.75    0.49    1.49    1.38    14.84    2.93    1.43    89.83
B4    4.71    3.18    0.34    1.87    1.27    10.60    3.26    3.87    269.64
B5    5.44    1.76    0.32    1.24    4.16    11.43    3.04    2.70    124.95
B6    8.76    1.77    0.34    1.25    1.00    30.73    3.27    3.62    155.67
B7    3.02    2.17    0.18    1.28    1.27    7.91    3.18    3.46    135.87
B8    12.32    1.86    0.18    1.35    1.47    51.77    2.99    3.29    180.8
B9    0.86    1.30    0.36    1.13    0.58    1.83    3.13    1.77    56.93
B10    1.83    2.87    0.41    1.79    1.66    6.06    3.67    1.97    96.94
B11    11.21    2.10    0.16    1.48    1.04    89.07    3.46    2.14    209.23
B12    1.07    1.61    0.00    0.94    0.74    2.57    3.18    1.29    46.63
B13    1.36    1.77    0.32    0.96    0.90    5.79    3.38    1.78    82.67
B14    2.34    1.63    0.31    1.14    0.95    10.89    3.26    3.60    91.49
B15    2.64    1.34    0.29    1.33    0.72    8.37    2.58    1.71    102.14
B16    0.95    1.04    0.23    1.20    0.56    2.10    2.27    0.86    70.87
X（A)    3.99    1.72    0.32    1.16    1.32    22.08    2.74    1.81    88.83
X（B)    3.9    1.9    0.25    1.23    1.3    16.66    3.12    2.47    119.53
P值    p＞0.05    p＞0.05    p＞0.05    p＞0.05    p＞0.05    p＞0.05    p＜0.05    p＜0.05    p＞0.05
注：统计学分析采用两独立样本 t 检验，P值＞0.05表示两样本无显著性差异，P值＜0.05表示两样本具显著性差异。
3讨论
利用732阳离子交换树脂富集蜂蜜中的氨基酸，采用PITC柱前衍生法测定32批国内外蜂蜜中17种氨基酸含量，结果显示，国内蜂蜜中天冬氨酸、谷氨酸、丝氨酸、甘氨酸、组氨酸、精氨酸、苏氨酸、丙氨酸、脯氨酸、缬氨酸、亮氨酸、色氨酸、赖氨酸平均含量低于国外蜂蜜；而国内蜂蜜中酪氨酸、蛋氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸平均含量高于国外蜂蜜，其中国内外两样本间组氨酸、脯氨酸、色氨酸、赖氨酸平均含量差异具有统计学意义。
国内16批蜂蜜中总游离氨基酸含量在37.7～171.33mg/100g，平均含量为88.83mg/100g，国外16批蜂蜜中总游离氨基酸含量在46.63～269.64 mg/100g，平均含量为119.53 mg/100g，经统计学检测，国内外两组样本均值无显著性差异。
研究显示，不同蜂蜜中氨基酸含量有一定差异，可作为鉴定蜂蜜蜜源植物，是否掺假的参考指标［5］。杨远帆等［9］采用茚三酮法比较了多批蜂蜜及果葡糖浆中氨基酸含量，结果得出多批蜂蜜中氨基酸含量均高于200 μg/g，而果葡糖浆中氨基酸含量则在10.1～47.8 μg/g范围内。理论上，若蜂蜜氨基酸含量低于200 μg/g时，则该蜂蜜中可能掺入了果葡糖浆。在德国，脯氨酸含量低于180 μg/g时，蜂蜜被定为未成熟蜜［10］。本研究显示国外蜂蜜总氨基酸平均含量高于国内蜂蜜，且脯氨酸平均含量远高于国内蜂蜜（P＜0.05），表明国外蜂蜜质量在一定程度上优于国产蜂蜜。

参考文献
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［6］杨远帆,倪辉,吴黎明. 茚三酮法测定蜂蜜及果葡糖浆中的氨基酸含量[J]. 中国食品学报,2013,13（02）:171-176.
［7］童蕾,王焰新,赵中一,等. 同步荧光光谱法测定蜂蜜中游离氨基酸[J]. 理化检验（化学分册）,2008,44（08）:757-759.
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［9］杨远帆,倪辉,吴黎明. 茚三酮法测定蜂蜜及果葡糖浆中的氨基酸含量[J]. 中国食品学报,2013,13（02）:171-176.
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