当前位置： 主页 > 资讯 >

柱前衍生-RP-HPLC法测定蜂王幼虫冻干粉中16种氨基酸含量

2018年03月14日已有人阅读病友分享我想学蜂疗

李智1，祁龙凯1，林励1*，李静1，黎香梅2，邝燕珍2
（1.广州中医药大学中药学院，广东广州510006； 2.广州市宝生园股份有限公司广东广州 510224）

Determination of amino acids in the frozen dry powder of queen bee larva by precolumn derivatization coupled with reversed-phase high performance liquid chromatography
Li Zhi1,Qi Long-kai1，Lin Li1*，Li Jing1，Li Xiang-mei2，Kuang Yan-zhen2
Abstract：Objective To establish a method for the determination of 16 amino acids in the frozen dry powder of queen bee larva by pre column derivatization and reversed-phase high performance liquid chromatography, and to determine the content of amino acid in the 29 batch of queen bee larva freeze dried powder by using this method. Methods Frozen dry powder of queen bee larva samples were precolumn derivatized with phenylisothiocyanate (PITC), separated using Waters Symmetry C18 chromatography column（4.6mm×250mm, 5µm）, gradient elution was performed with acetonitrile-water (4:1) solution and 0.03 mmol/L sodium acetate-acetonitrile (355-15, ph=6.5), flow rate was 1.0 mL/min, wavelength was 254 nm. Results The calibration curves of 16 amino acids exhibited good linearity over the range from 0.0625 to 1.2500 mmol/L. Mean recoveries for amino acids and biogenic amines were between 94.97%and 99.50%. The limits of detection (LODs)for 16 free amino acids were in the range of 0.0005–0.0015 mmol/L, and the limits of quantification (LOQs)were 0.0075–0.0240 mmol/L. Conclusion The method is simple, convenient, accurate and stable, and it is suitable for the quantitative detection of the amino acid in the freeze-dried powder of queen bee larvae.
Key words：frozen dry powder of queen bee larva；amino acids； pre column derivatization；reversed-phase high performance liquid chromatography (RP-HPLC).

蜂王幼虫又称蜂王胎，为王台里蜜蜂受精卵吸收消化工蜂分泌的新鲜蜂王浆而生长发育的幼虫，为生产蜂王浆过程中的副产品。我国是世界第一的养蜂大国，年产蜂王浆3000余吨，按平均浆虫比5:1计算，蜂王幼虫年产量可在600吨左右［1］。随着科研工作者对蜂王幼虫化学成分的研究，发现蜂王幼虫含有丰富的蛋白质，可达干重的50%左右［2］，且其功效比值、生物价及蛋白质净利用率均于大豆分离蛋白一致，是一种优良的动物蛋白资源［3-4］，同时其含有丰富的维生素、矿物质、生物活性酶等成分，具有极高的营养价值。大量研究证实，蜂王幼虫同时具有抗衰老［5-6］、抗氧化［7］、提高免疫力［8］、抗疲劳［9］等保健功效。蜂王幼虫因其含水量高（75%左右），营养丰富，常规加工方法由于受热时间长，产品品质较差，而低温冻干技术，可充分保存其营养成分与生物活性成分活性。

目前，蛋白质的氨基酸组成分析较多采用氨基酸分析仪测定，但氨基酸分析仪专属性强，购置费用高，限制了该技术的广泛应用，其普及程度远不及高效液相色谱仪。70年代后，随着柱前衍生与高效液相色谱技术发展，柱前衍生高效液相色谱法越来越多应用于氨基酸分析。目前常用柱前衍生试剂主要有异硫氰酸苯酯（PITC）［10］、丹磺酰氯［11］、领苯二甲醛（OPA）［12］及6-氨基喹啉-N-羟基琥珀酰亚胺基氨基甲酸酯（AQC）［13］。本研究采用PITC柱前衍生高效液相色谱法测定蜂王幼虫冻干粉中16种氨基酸的含量，为其质量控制提供一种科学的分析方法。

材料

1.1原料： 29批蜂王幼虫冻干粉（由广州市宝生园股份有限公司提供）。

1.2 试剂

异硫氰酸苯酯（PITC，纯度≥98.0%，氨基酸分析专用）、三乙胺（纯度≥98.0%，氨基酸分析专用）、无水醋酸钠（分析纯）、L-正亮氨酸（纯度≥98.0%）：阿拉丁试剂有限公司；17种氨基酸混合对照品溶液：美国Sigma公司；乙腈（色谱纯）：德国Merck公司；高纯氮气（纯度≥99.999%）:佛山德力梅塞尔气体有限公司；浓盐酸（优级纯）、苯酚（分析纯）：广州化学试剂厂；冰醋酸（色谱纯）：天津科密欧化学试剂有限公司。

1.3 仪器

Waterse2695高效液相色谱仪（PDA检测器）：美国Waters公司；Milli-Q Reference超纯水系统：德国默克密理博公司；TGL-18G-C高速离心机：上海安亭科学仪器厂；PHS-3C型精密pH计：上海盛磁仪器有限公司；DHG-9053A电热恒温鼓风干燥箱：上海精宏实验设备有限公司；XW-80A漩涡混合器：海门市其林贝尔仪器制造有限公司。

2 方法

2.1 标准工作溶液的配制

取16种氨基酸混合标准品溶液适量，分别用0.1 mol/L盐酸稀释20、15、10、5、2.5、0倍，制成混合标准系列梯度溶液。

2.2 样品酸水解

精密称取蜂王幼虫冻干粉100 mg，置于水解管中，加入6 mol/L盐酸（含1%苯酚），反复抽真空充氮气三次后，封口，110℃水解22 h，水解液置水浴锅上60 ℃挥干溶剂，残渣用适量0.1 mol/L盐酸溶解，经10000 r/min离心15 min，取上清液，用0.1 mol/L盐酸定容至25 mL，即得。

2.3 样品衍生化：精密量取1 mL样液于5 mL具塞离心管中，分别加入2.50 mmol/L正亮氨酸溶液50 µL、14%三乙胺-乙腈溶液300 µL和1.25% PITC-乙腈200 µL，旋涡混匀器震荡1 min，室温下静置放置60 min，加入2 mL正己烷，旋涡混匀器震荡1 min后静置10 min，取下层清夜过0.22 µm有机滤膜，待测。

2.4 色谱条件

色谱柱：Waters Symmetry C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 µm）；流动相A： 30 mmol/L醋酸钠溶液-乙腈（355:15，V/V），冰醋酸调PH至6.5；流动相B：乙腈-水（4:1，V/V）；流速：1 mL/min；柱温：40℃；进样量：10 µL；检测波长：254 nm；梯度洗脱程序见表1。

          表 1 梯度洗脱程序

          Table 1 Gradient elution program
时间/min    流动相A    流动相B
0    100    0
10    92    8
20    90    10
21    80    20
40    68    32
45    0    100

2.5数据处理：采用Excel和SPSS19.0软件对数据进行统计分析。每组样品平行测定3次，测定结果取平均值。

3 结果与分析

3.1 衍生条件优化

考察了添加100、200、300、400、500 µL不同体积的14%三乙胺-乙腈溶液对衍生反应的影响。结果显示14%三乙胺-乙腈添加量在300 µL以后，结果差异不显著，其中添加量为100 µL时，氨基酸无法衍生，该衍生反应需要在一定碱性条件下进行，若三乙胺加入量不足，则无法调整反应体系至所需碱性环境，因此14%三乙胺-乙腈溶液添加量选为300 µL。考察添加50、100、200、300、400 µL等不同体积的1.25% PITC-乙腈溶液对衍生反应的影响，结果当加入量大于200 µL时，测定结果无显著性差异，因此1.25% PITC-乙腈溶液添加量为200 µL。考察15、30、45、60、75 min等不同衍生时间对对衍生反应的影响，结果衍生60min后，结果差异不显著，因此选用60 min作为样品的衍生时间。最终衍生条件确定为加入14%三乙胺-乙腈溶液300 µL，加入1.25% PITC-乙腈溶液200 µL，混匀后反应60 min。

3.2 色谱条件优化

比较了10、20、30、40、50 mmol/L等不同浓度醋酸钠缓冲溶液（pH=6.5）-乙腈溶液（355:15）对分离效果影响，结果醋酸钠缓冲液浓度为30 mmol/L及以上时，16种氨基酸分离效果好，考虑低浓度缓冲盐对柱子损伤小，因此选用30 mmol/L醋酸钠缓冲溶液（pH=6.5）-乙腈溶液（355:15）作为流动相A。采用冰醋酸调整30 mmol/L醋酸钠缓冲溶液（pH=6.5）-乙腈溶液（355:15）的pH值，比较了4.5、5.0、6.0、6.5、7.0、7.5等不同pH值流动相对17种氨基酸分离效果影响，结果pH为6.5时，分离效果最好。在上述色谱条件下，通过对洗脱程序进行调整，可使标准品溶液与样品溶液中17种氨基酸在48 min内实现基线分离，各氨基酸之间无干扰，标准品色谱图和样品色谱图分别见图1和图2。
1-天冬氨酸、2-谷氨酸、3-丝氨酸、4-甘氨酸、5-组氨酸、6-苏氨酸、7-精氨酸、8-丙氨酸、9-脯氨酸、10-酪氨酸、11-缬氨酸、12-蛋氨酸、13-异亮氨酸、14-亮氨酸、15-苯丙氨酸、16-赖氨酸

1-aspartic acid、2-glutamic acid、3-serine、4-glycine、5-histidine、6-threonine、7-arginine、8-alanine、9-proline、10-tyrosine、11-valine、12-methionine、13-isoleucine、14-leucine、15-phenylalanine、16-lysine

图1 混合对照品高效液相色谱图

Fig 1 HPLC Chromatograms of mixed reference substance

1-天冬氨酸、2-谷氨酸、3-丝氨酸、4-甘氨酸、5-组氨酸、6-苏氨酸、7-精氨酸、8-丙氨酸、9-脯氨酸、10-酪氨酸、11-缬氨酸、12-蛋氨酸、13-异亮氨酸、14-亮氨酸、15-苯丙氨酸、16-赖氨酸

1-aspartic acid、2-glutamic acid、3-serine、4-glycine、5-histidine、6-threonine、7-arginine、8-alanine、9-proline、10-tyrosine、11-valine、12-methionine、13-isoleucine、14-leucine、15-phenylalanine、16-lysine

图2 样品高效液相色谱图（Fig 2 HPLC Chromatograms of sample）

3.3 标准曲线、检出限、定量限测定结果

以氨基酸摩尔质量浓度为横坐标X，以峰面积与正亮氨酸峰面积比值为纵坐标Y，绘制标准曲线，得出相应线性关系，结果见表2；将标准品溶液等倍逐步稀释，衍生后进样分析，记录峰面积。当信噪比为3∶1时，得检测限（LOD）；当信噪比为10∶1时，得定量限（LOQ），结果见表2。

表 2 氨基酸回归方程与线性范围

Table 2 Regression equations and linear ranges of amino acid

氨基酸    回归方程    线性范围/（mmol/L）    r    LOD/（mmol/L）    LOQ/（mmol/L）
天冬氨酸    Y=1.4091X+0.1216    0.0625～1.2500    0.9989    0.0015    0.0150
谷氨酸    Y=1.1104X+0.0783    0.0625～1.2500    0.9984    0.0012    0.0180
丝氨酸    Y=1.2085X+0.0870    0.0625～1.2500    0.9991    0.0007    0.0085
甘氨酸    Y=1.9433X+0.0194    0.0625～1.2500    0.9997    0.0009    0.0180
组氨酸    Y=1.5525X+0.0638    0.0625～1.2500    0.9978    0.0005    0.0100
精氨酸    Y=1.5201X+0.0580    0.0625～1.2500    0.9982    0.0005    0.0125
苏氨酸    Y=1.2107X+0.1074    0.0625～1.2500    0.9993    0.0006    0.0120
丙氨酸    Y=1.4772X+0.0592    0.0625～1.2500    0.9974    0.0008    0.0136
脯氨酸    Y=2.2495X0.0036    0.0625～1.2500    0.9998    0.0006    0.0120
酪氨酸    Y=2.0886X+0.0232    0.0625～1.2500    0.9998    0.0005    0.0080
缬氨酸    Y=1.7909X+0.0739    0.0625～1.2500    0.9986    0.0006    0.0090
蛋氨酸    Y=1.6610X+0.0766    0.0625～1.2500    0.9989    0.0005    0.0080
异亮氨酸    Y=1.9422X+0.0908    0.0625～1.2500    0.9996    0.0006    0.0240
亮氨酸    Y=1.9774X+0.0381    0.0625～1.2500    0.9994    0.0006    0.0090
苯丙氨酸    Y=2.0761X+0.0240    0.0625～1.2500    0.9997    0.0005    0.0090
赖氨酸    Y=3.6626X+0.0606    0.0625～1.2500    0.9990    0.0005    0.0075

3.4 精密度和加样回收率实验结果

取混合标准品溶液，依照本实验方法，平行测定6次，结果16种氨基酸6次测定相对标准偏差（RSD）在0.62%～1.47%之间，说明仪器精密度良好。取蜂王幼虫冻干粉样品酸解液0.5 mL，分别加入0.5 mL不同浓度混合标准品溶液，平行测定6次，结果16种氨基酸平均加样回收率在94.97%～99.50%之间，RSD在1.13%～4.17%之间，表明该方法加样回收率良好，详情见表3。

表 3 加样回收率实验结果

Table 3 Results of sample recovery

氨基酸    本底值/mg    加标量/µg    测得量/µg    平均回收率/%    RSD/%
        1    2    3    1    2    3
天冬氨酸    0.1025    0.0832    0.0416    0.0208    0.1848    0.1429    0.1218    96.28    3.27
谷氨酸    0.1041    0.0920    0.0460    0.0230    0.1948    0.1487    0.1260    96.92    1.74
丝氨酸    0.0479    0.0657    0.0328    0.0164    0.1142    0.0796    0.0632    96.95    3.94
甘氨酸    0.0436    0.0469    0.0235    0.0117    0.0890    0.0655    0.0550    95.81    2.39
组氨酸    0.0317    0.0970    0.0485    0.0242    0.1258    0.0800    0.0542    96.53    3.45
精氨酸    0.0551    0.1089    0.0544    0.0272    0.1601    0.1081    0.0825    98.20    2.30
苏氨酸    0.0442    0.0745    0.0372    0.0186    0.1159    0.0802    0.0618    95.88    1.17
丙氨酸    0.0436    0.0557    0.0278    0.0139    0.0975    0.0701    0.0565    94.97    2.11
脯氨酸    0.0638    0.0720    0.0360    0.0180    0.1348    0.0989    0.0807    96.67    2.55
酪氨酸    0.0447    0.1132    0.0566    0.0283    0.1567    0.0998    0.0721    97.70    1.13
缬氨酸    0.0536    0.0732    0.0366    0.0183    0.1243    0.0895    0.0720    98.41    2.04
蛋氨酸    0.0190    0.0933    0.0466    0.0233    0.1105    0.0648    0.0428    99.50    2.31
异亮氨酸    0.0475    0.0820    0.0410    0.0205    0.1256    0.0869    0.0683    97.60    3.45
亮氨酸    0.0718    0.0820    0.0410    0.0205    0.1506    0.1140    0.0914    98.21    4.17
苯丙氨酸    0.0469    0.1032    0.0516    0.0258    0.1486    0.0960    0.0712    95.97    2.39
赖氨酸    0.0556    0.0914    0.0457    0.0228    0.1430    0.0991    0.0782    96.64    2.23

3.5 样品测定结果

取各批次样品，分别照本文上述方法水解、衍生、测定，计算其中所含的16种氨基酸含量。
表 4 蜂王幼虫冻干分中氨基酸含量

Table 4 The content of amino acid in the Queen bee larva freeze dried powder
样品编号    氨基酸/（mg/g）
    天冬氨酸    谷氨酸    丝氨酸    甘氨酸    组氨酸**    精氨酸**    苏氨酸*    丙氨酸    脯氨酸    酪氨酸    缬氨酸*
BSY2015001    51.27    52.03    23.97    21.80    15.85    27.53    22.09    21.80    31.91    22.34    26.80
BSY2015002    55.49    59.84    25.61    24.07    15.51    28.38    22.24    23.36    34.89    23.94    29.88
BSY2015003    55.72    60.35    24.74    23.00    14.78    27.39    21.51    22.90    32.70    24.07    29.65
BSY2015004    54.79    57.54    25.19    23.57    15.48    27.78    21.98    23.02    33.67    23.46    29.61
BSY2015005    52.56    58.13    25.79    24.17    16.22    28.08    21.93    22.69    36.20    24.59    28.58
BSY2015006    53.51    54.65    24.41    21.31    15.25    27.61    22.37    22.94    29.64    22.86    27.76
BSY2015007    55.74    58.50    25.37    22.24    15.77    28.59    23.17    23.15    30.26    23.10    29.29
BSY2015008    54.62    57.32    24.89    22.20    14.59    27.45    21.74    22.56    30.59    23.87    28.96
BSY2015009    55.57    56.58    25.03    21.88    14.23    26.89    21.77    22.35    30.40    23.53    28.59
BSY2015010    57.53    61.22    25.95    22.19    14.55    27.96    22.42    23.50    29.50    23.81    29.53
BSY2015011    57.11    61.45    26.09    21.94    13.85    27.63    22.14    23.43    29.63    24.33    29.19
BSY2015012    56.34    59.78    25.65    21.78    16.34    28.35    22.94    23.48    28.59    22.94    28.53
BSY2015013    51.64    53.87    23.54    20.30    14.31    25.71    20.54    21.34    26.44    21.11    26.60
BSY2015014    56.92    59.24    25.19    21.12    13.89    25.84    26.48    22.08    28.64    23.37    27.64
桐庐保灵2014    51.98    58.95    23.00    21.50    13.93    26.49    20.64    23.02    28.42    23.22    27.81
安徽保灵2015-1    52.26    58.62    24.41    22.10    15.36    28.05    22.14    22.06    29.73    22.88    27.84
安徽保灵2015-2    55.43    59.31    24.32    21.48    13.77    26.78    21.05    21.52    27.37    23.47    29.94
QC保灵    55.09    57.02    24.53    20.15    14.02    25.94    21.08    22.44    26.18    22.34    27.25
江苏南通2015-1    54.07    54.46    23.85    20.60    13.65    25.47    20.37    21.21    26.91    21.69    27.27
江苏南通2015-2    57.01    55.94    25.09    19.08    13.65    25.96    21.63    22.11    23.70    21.24    26.09
湖北荆门2014-1    56.79    60.91    26.25    21.28    15.23    28.79    23.81    24.10    26.80    23.66    28.43
湖北荆门2014-3    54.97    59.95    24.39    20.18    13.59    26.51    21.35    22.53    26.09    22.41    26.97
湖北荆门2015-2    56.05    59.37    26.21    20.51    15.52    29.18    23.70    23.54    27.30    22.90    28.32
湖北荆门2015-3    59.97    58.35    26.21    20.49    15.67    28.39    23.28    22.97    25.22    21.91    28.90
12032901FTF    57.92    56.83    25.04    20.18    13.97    27.46    22.32    23.18    27.01    22.84    28.25
12112002FTF    54.91    55.40    24.84    20.73    14.16    27.08    21.95    23.00    28.59    22.85    27.56
13050701FTF    55.32    58.03    24.84    22.30    14.40    27.29    21.72    23.12    32.27    24.25    28.64
14071701FTF    58.23    57.02    25.04    21.44    14.32    27.52    22.14    22.37    28.84    23.55    28.62
15060701FTF    57.04    55.87    25.50    22.16    15.37    28.85    23.34    23.10    31.57    24.11    27.91

样品编号    氨基酸/（mg/g）    TAA    EAA    NEAA    EAA/TAA
（%）    EAA/NEAA
（%）
    蛋氨酸*    异亮氨酸*    亮氨酸*    苯丙氨酸*    赖氨酸*
BSY2015001    9.51    23.74    35.90    23.45    27.81    437.80    212.68    225.12    48.58    94.47
BSY2015002    10.16    26.77    39.89    25.32    30.35    475.70    228.50    247.20    48.03    92.44
BSY2015003    9.92    25.87    38.48    24.17    30.67    465.92    222.44    243.48    47.74    91.36
BSY2015004    10.07    26.29    39.01    24.87    30.35    466.68    225.44    241.24    48.31    93.45
BSY2015005    9.99    25.19    38.54    24.82    28.02    465.5    221.37    244.13    47.56    90.68
BSY2015006    9.85    24.11    36.71    23.12    28.57    444.67    215.35    229.32    48.43    93.91
BSY2015007    9.60    25.87    38.36    23.96    30.71    463.68    225.32    238.36    48.59    94.53
BSY2015008    9.72    25.53    38.48    24.21    30.17    456.9    220.85    236.05    48.34    93.56
BSY2015009    9.98    24.85    37.86    23.79    30.33    453.63    218.29    235.34    48.12    92.76
BSY2015010    10.37    25.87    39.10    23.91    32.21    469.62    225.92    243.70    48.11    92.70
BSY2015011    10.28    25.38    38.37    23.87    31.54    466.23    222.25    243.98    47.67    91.09
BSY2015012    9.96    25.37    38.04    23.12    31.97    463.18    224.62    238.56    48.50    94.16
BSY2015013    9.20    23.51    35.56    21.49    29.37    424.53    206.29    218.24    48.59    94.52
BSY2015014    9.37    24.57    36.50    22.91    31.22    454.98    218.42    236.56    48.01    92.33
桐庐保灵2014    9.89    25.07    37.08    22.38    33.22    446.6    216.51    230.09    48.48    94.10
安徽保灵2015-1    9.91    24.89    37.16    22.54    33.76    453.71    221.65    232.06    48.85    95.51
安徽保灵2015-2    10.34    25.18    37.19    22.51    36.06    455.72    222.82    232.90    48.89    95.67
QC保灵    9.51    24.05    36.00    21.62    23.38    430.6    202.85    227.75    47.11    89.07
江苏南通2015-1    9.68    23.69    35.74    21.71    35.83    436.2    213.41    222.79    48.92    95.79
江苏南通2015-2    9.18    22.29    34.65    20.36    33.40    431.38    207.21    224.17    48.03    92.43
湖北荆门2014-1    10.33    24.61    37.39    21.98    36.31    466.67    226.88    239.79    48.62    94.62
湖北荆门2014-3    9.53    23.63    36.08    21.31    35.09    444.58    214.06    230.52    48.15    92.86
湖北荆门2015-2    9.64    24.11    36.68    21.51    34.00    458.54    222.66    235.88    48.56    94.40
湖北荆门2015-3    10.13    24.67    36.52    21.62    36.93    461.23    226.11    235.12    49.02    96.17
12032901FTF    9.66    23.39    36.64    22.17    31.26    448.12    215.12    233.00    48.00    92.33
12112002FTF    9.47    24.07    36.95    23.36    29.94    444.86    214.54    230.32    48.23    93.15
13050701FTF    10.10    24.99    38.25    24.11    30.26    459.89    219.76    240.13    47.79    91.52
14071701FTF    9.88    25.15    38.11    23.22    31.45    456.9    220.41    236.49    48.24    93.20
15060701FTF    10.25    24.27    38.08    23.91    30.26    461.59    222.24    239.35    48.15    92.85
注：TAA为总氨基酸；EAA为必需氨基酸；NEAA为非必需氨基酸；*为必需氨基酸；**为半必需氨基酸

4 结论

4.1 采用高效液相色谱法建立了一种快速、简便分析蜂王幼虫冻干粉中16种氨基酸含量的方法，该法各氨基酸均达到基线分离，相互间无干扰，线性相关系数均≥0.9974，平均加样回收率在94.97%～99.50%，相对标准偏差（RSD）≤4.17%。该方法简便易行、准确性高、稳定性好，适于蜂王幼虫冻干粉中氨基酸定量检测。

4.2 所测29批次蜂王幼虫冻干粉不同批次样本16种氨基酸含量差异均较小，总氨基酸（TAA）含量在424.53 mg/g～475.70mg/g，必需氨基酸（EAA）含量在202.85 mg/g～228.50mg/g，非必需氨基酸(NEAA)含量在218.24mg/g～247.20mg/g，EAA/TAA在47.11%～49.02%，EAA/NEAA在89.07%～96.17%。依据FAO/WHO推荐的理想蛋白模式，优质蛋白的EAA/TAA在40%左右，EAA/NEAA在60%以上［14］，提示所测蜂王幼虫冻干粉样品所含蛋白为优质蛋白质，人体必需氨基酸含量高，具有良好的营养价值。

参考文献：
[1]沈平锐, 罗光华. 蜂王胎食用开发价值的研究[J]. 食品工业科技, 1991 (6): 21-26.
[2]殷客卿, 杨寒冰, 陈晶, 等. 蜂王幼虫的营养成分分析[J]. 蜜蜂杂志, 2010, 7: 3-6.
[3]周瑞华, 唐永梅, 周小芸. 蜂王幼虫蛋白质的营养评价[J]. 食品科学, 1991, 6: 12-15.
[4]金庆武, 周瑞华. 蜂王幼虫干粉蛋白质的生物利用率和营养食效性研究[J]. 中国自然医学杂志, 2003, 5(4): 249-251.
[5]倪彬, 陈丰, 刘建伟, 等. 蜂王幼虫粉延缓衰老和抗应激能力的实验研究[J]. 营养学报, 2002, 24(4): 398-400.
[6]岑宁, 孙鸿才. 蜂王胎抗衰作用研究初报[J]. 中国养蜂, 1999, 50(1): 10-10.
[7]贾歌. 蜂王幼虫蛋白质酶解物的制备及抗氧化活性的研究[D]. 西北大学, 2014.
[8]周瑞华, 裴银辉. 蜂王幼虫对小鼠免疫功能的影响及机理探讨[J]. 食品科学, 1999, 20(11): 11-13.
[9]朱海波. 复方蜂王胎口含片的研制及其抗疲劳功能的实验研究[D].福建农林大学,2007.
[10]芮鸿飞, 张晓瑜, 刘兴泉, 等. PITC 柱前衍生-反相高效液相色谱法测定黄酒中游离氨基酸和生物胺[J]. 食品科学, 2016, 8: 028.
[11]朱晓伟, 高新星, 安芳, 等. 柱前衍生化 HPLC-荧光检测法测定高血压患者尿液中 22 种游离氨基酸的浓度[J]. 中国药房, 2010 (30): 2823-2825.
[12]吕汶骏, 赵钟兴, 廖丹葵, 等. 蚕蛹蛋白及其水解产物中氨基酸组成分析[J]. 食品科学, 2012, 33(12): 228-232.
[13]黄莉, 吴小曼, 纪宇, 等. 柱前衍生高效液相色谱法测定胎盘多肽注射液中的氨基酸[J]. 中国生化药物杂志, 2012, 33(4): 373-376.
[14]谭爱华, 刘发志, 张曙光. 紫陀螺菌蛋白质的营养评价[J]. 食用菌学报, 2003, 10(4): 24-28.